Crioconservazione
Cosa sono le tecniche di crioconservazione?
La crioconservazione è una procedura che consente di mantenere cellule e tessuti in uno stato vitale per diverso tempo, grazie a temperature criogeniche, e di riportarle successivamente a temperatura ambiente per ripristinarne l’attività.
Le tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita consentono di crioconservare:
• Embrioni
• Ovociti
• Spermatozoi
• Tessuto ovarico
La conservazione a lungo termine delle cellule è possibile se il metabolismo viene arrestato, e questo accade se le cellule sono conservate a -196 °C (la temperatura dell’azoto liquido).
A -196 °C non è rilevabile alcuna attività biochimica perché non c’è sufficiente quantità di energia termica per l’avvenimento di reazioni chimiche e non c’è acqua allo stato liquido, che è essenziale per i processi metabolici. Oggi, nella maggior parte dei casi, si segue il protocollo della vitrificazione, sia in fase di congelamento che di scongelamento.
Crioconservazione degli ovociti
Possono essere utilizzati in un secondo tempo per iniziare una procedura di fecondazione assistita.
Per aumentare le probabilità di sopravvivenza degli ovociti e la possibilità di fecondarli dopo la crioconservazione, la donna si sottopone a una stimolazione ormonale per produrre un maggior numero di ovociti.
Segue il prelievo ovocitario in sedazione assolutamente indolore.
La crioconservazione degli ovociti per preservare la propria fertilità dovrebbe essere effettuata prima dei 35 anni, così da aumentare le chances di riuscita.
In quali casi è indicata?
- A donne che vogliono pianificare la gravidanza nei tempi da loro ritenuti idonei.
- Per creare una “riserva di fertilità” alle donne che devono sottoporsi a chemioterapia o radioterapia o che rischiano di diventare sterili per esaurimento ovarico prematuro.
Come viene effettuata la crioconservazione degli ovociti?
In alternativa al tradizionale procedimento di congelamento lento (slow-freezing), in cui il campione viene gradualmente portato a -150°C e successivamente immerso in azoto liquido (-196°C), attualmente si preferisce l’impiego di una nuova tecnica di crioconservazione all’avanguardia, la Vitrificazione.
Questa tecnica consente di congelare ovociti in modo molto rapido, passando direttamente allo stato “vitreo”, impedendo così la formazione di cristalli di ghiaccio, che possono danneggiare le delicate strutture dell’ovocita.
Il congelamento degli ovociti mediante vitrificazione è ritenuto oggi essere la tecnica più efficace, con ottimi risultati in termini di sopravvivenza (96.5%) e sviluppo embrionale. I tassi di gravidanza sono anch’essi molto incoraggianti.
Crioconservazione degli spermatozoi
La crioconservazione dei gameti maschili permette all’uomo di utilizzare i propri spermatozoi in tutte quelle situazioni che possono mettere a rischio la sua fertilità anche solo temporaneamente (chemioterapia, radioterapia, interventi chirurgici),
offrendo alle coppie la possibilità di accedere successivamente a tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA).
In quali casi è indicata?
- Partner che non può essere presente al momento dell’intervento di procreazione assistita per motivi professionali o di altro genere.
- Casi di natura psicologica (difficoltà nella raccolta il giorno dell’inseminazione intrauterina e della fecondazione in vitro).
- Casi di prelievo del seme mediante TESA o PESA.
- Pazienti che stanno per essere sottoposti a chemio e/o radio-terapia.
- Soggetti che svolgono attività ad alto rischio come i radiologi, gli operatori di centrali nucleari, operatori radar e altri ancora.
- Pazienti che presentano severe patologie del liquido seminale (oligoastenoteratozoospermia) che possono peggiorare nel corso degli anni.
- Pazienti che devono sottoporrsi a tecniche di fecondazione in vitro e presentano parametri molto compromessi del liquido seminale (meno di 1 milione di spermatozoi nell’eiaculato). In questi casi diventa possibile, attraverso il congelamento di raccolte successive di liquido seminale effettuate in giorni differenti, accumulare un numero sufficiente di spermatozoi per un ciclo terapeutico.
- Casi in cui è previsto un intervento chirurgico alla prostata o ai testicoli.
- Casi di disfunzione erettile, disfunzione sessuale caratterizzata dalla incapacità di sviluppare o mantenere l’erezione del pene durante la prestazione sessuale.
- Casi di disfunzione eiaculatoria, in cui gli uomini non possono eiaculare, come nel caso di lesione del midollo spinale.
- Casi di eiaculazione retrograda, in cui lo sperma, che normalmente sarebbe eiaculato attraverso l’uretra, viene reindirizzato alla vescica urinaria.
Come viene effettuata la crioconservazione degli spermatozoi?
Il metodo standard per la crioconservazione dei gameti maschili da liquido seminale (dall’eiaculato) o da tessuto testicolare (da biopsia testicolare), prevede la conservazione in azoto (liquido o vapori) alla temperatura di -196°C mediante l’impiego di particolari sostanzenon citotossiche, i crioprotettori, che tendonoa ridurre i principali danni da crioconservazione, ovvero la formazione intracellulare di ghiaccio e a ridurre i principali danni da crioconservazione, ovvero la formazione intracellulare di ghiaccio e lo stress osmotico.
In generale è importante sottolineare che il processo di congelamento-scongelamento può portare fino ad una perdita del 50% della motilità degli spermatozoi.
Crioconservazione degli embrioni
La crioconservazione degli embrioni costituisce parte essenziale dei trattamenti di riproduzione assistita, poiché consente di conservare gli embrioni per utilizzarli in un secondo momento.
Attualmente viene utilizzata la tecnica di vitrificazione, che ha aumentato in modo esponenziale il numero di embrioni idonei rispetto a quelli trasferiti “in fresco”.
Questa tecnica di congelamento è davvero poco aggressiva per gli embrioni (rispetto alle antiche tecniche di congelamento lento), e ciò permette di ottenere tassi di sopravvivenza e gestazione molto alti.
Gli embrioni possono essere vitrificati in qualsiasi fase del loro sviluppo, da quella più precoce di due cellule fino allo stadio di blastocisti (cioè 5 giorni dopo la fecondazione) e conservati in banche criogeniche.
In quali casi è indicata?
In conformità a quanto disposto dall’articolo 14 della legge n. 40/2004, la crioconservazione degli embrioni è possibile:
- Per limitare i rischi correlati all’insorgenza di gravidanze multiple e alla ripetizione di cicli di stimolazione ovarica.
- Per consentire alla coppia l’ottenimento di una probabilità ottimale di successo.
- Nel caso in cui sussistano impedimenti imprevisti al trasferimento degli embrioni formati.
Come viene effettuata la crioconservazione degli embrioni?
In alternativa al tradizionale procedimento di congelamento lento (slow-freezing), in cui il campione viene gradualmente portato a -150°C e successivamente immerso in azoto liquido (-196°C), attualmente per criopreservare gli embrioni è necessario sottometterli a temperature molto basse (-196°C), utilizzando l’azoto liquido.
A queste temperature qualsiasi attività biologica si arresta, mantenendo intatta la sua fisiologia. Tuttavia, durante il congelamento si possono formare cristalli di ghiaccio che possono danneggiare le cellule.
Per evitare questo problema, vengono impiegate particolari sostanze non citotossiche, i crioprotettori, che tendono a ridurre i principali danni da crioconservazione, ovvero la formazione intracellulare di ghiaccio e lo stress osmotico.
Gli embrioni vengono correttamente identificati da un codice e conservati congelati in serbatoi di azoto, registrando la loro posizione per una facile ricerca.
Ogni paziente ha i suoi embrioni situati in una zona esclusiva nei contenitori di criocustodia, non condivisa con altri campioni o pazienti, in maniera che vengano salvaguardate le possibili contaminazioni crociate o menomazioni.
Attualmente viene attuata la Tecnica di Vitrificazione che consente di ottenere tassi di sopravvivenza del 90%.
Crioconservazione del tessuto ovarico
La crioconservazione di tessuto ovarico si presenta come una valida e applicabile alternativa al congelamento degli ovociti e degli embrioni, in grado di preservare sia la funzione gametogenica che steroidogenica, in bambine e in giovani donne affette da neoplasie.
È necessario specificare che questa tecnica è ancora considerata sperimentale.
La crioconservazione del tessuto ovarico, diversamente dal congelamento degli ovociti, può essere realizzata in qualsiasi momento del ciclo mestruale, evitando ritardi nell’inizio della terapia antitumorale, in quanto non richiede stimolazione ormonale.
Un ulteriore vantaggio della crioconservazione di tessuto ovarico è il possibile recupero di follicoli primordiali in numero tanto maggiore quanto minore è l’età della paziente.
I follicoli primordiali contengono ovociti immaturi e quiescenti e risultano essere molto resistenti ai processi di congelamento e scongelamento.
La crioconservazione con il successivo reimpianto di tessuto ovarico, inoltre, permette di ripristinare sia la funzione riproduttiva sia la funzionalità endocrina.
Ciò garantisce un miglioramento della qualità della vita nelle pazienti adulte, evitando la menopausa precoce, e nelle pazienti pre-puberi, consentendo un normale sviluppo fisiologico.
In quali casi è indicata?
- Neoplasie del sistema emopoietico: linfoma di Hodgkin e non Hodgkin, leucemia mieloblastica e linfoblastica acuta.
- Malattie extra-pelviche: osteosarcoma, sarcoma di Ewing, carcinoma tiroideo, renale e mammario, neuroblastoma, tumore dell’intestino.
- Malattie pelviche: neoplasie non ginecologiche come il sarcoma pelvico, sarcoblastoma, rabdomiosarcoma, tumore sacrale, neoplasie retto-sigmoidali.
- Tumori maligni ginecologici: carcinoma precoce vaginale, vulvare e della cervice.
- Malattie infiammatorie: morbo di Chron, lupus eritematoso, artrite reumatoide.
- Anomalie cromosomiche associate alla scarsa presenza di follicoli ovarici. In particolare, bambine affette dalla sindrome di Turner che comporta la distruzione degli ovociti al momento della pubertà, ma per altri versi in gran parte dei casi permette una vita assolutamente normale. Le ovaie di questi soggetti prima della pubertà contengono ovociti che possono essere preservati mediante congelamento di un frammento ovarico e sottratti all’atresia indotta dalla malattia.
- Endometriosi severe.
Come viene effettuata la crioconservazione del tessuto ovarico?
Prelievo di frammenti ovarici: la biopsia di corticale ovarica si può prelevare durante un intervento laparoscopico o laparotomico, in anestesia.
La biopsia laparoscopica di corticale ovarica può essere programmata in qualsiasi fase del ciclo mestruale ed è organizzabile in pochi giorni.
I frammenti (almeno 3) cubici di almeno 8mm di lato vengono immediatamente posizionati in un terreno di coltura tamponato e trasportati, in ghiaccio non secco, dalla sala operatoria al laboratorio del mio Centro di Procreazione Medicalmente Assistita.
Qualora il prelievo venisse eseguito da entrambe le ovaie, bisogna tenere separate le biopsie per tutto il processo di congelamento.
Frammenti di ovaio vengono inviati dalla sala operatoria all’Anatomia Patologica per escludere presenza di cellule neoplastiche e per valutare la conta follicolare (follicoli/mm2).
In laboratorio si procede alla dissezione meccanica del tessuto che ha lo scopo di isolare la corticale ovarica dalla midollare.
I frammenti di corticale ovarica devono essere di piccole dimensioni in modo da favorire la penetrazione dei crioprotettori e preservare in tal modo l’integrità strutturale e funzionale del tessuto durante il processo di congelamento.
Il materiale crioconservato viene scongelato al momento del ritrapianto. I campioni congelati vengono prima esposti a temperatura ambiente e poi immersi in bagni alla temperatura di 30°C.
In seguito i frammenti vengono scongelati attraverso una serie di passaggi in soluzioni di scongelamento contenenti concentrazioni decrescenti di crioprotettori.
Al termine dello scongelamento i frammenti vengono trasportati a temperatura ambiente in terreno tamponato in sala operatoria per il ritrapianto.
FAQ
Sì, è possibile effettuare la crioconservazione dei gameti e degli embrioni per le coppie seguite nel mio Centro e per le persone che devono sottoporsi a trattamenti oncologici.
Sì è possibile, secondo le normative vigenti.
È la possibilità di conservare i propri spermatozoi in appositi contenitori posti presso centri specializzati, sfruttando la capacità che hanno queste cellule di sopravvivere al congelamento in azoto liquido, a – 196°C. Una volta scongelati, gli spermatozoi hanno la capacità di riprendere la loro funzione e il loro movimento.
Certo, è possibile crioconservare embrioni allo stadio di blastocisti.
L’indicazione medica e biologica prevede che si possano congelare ovociti non oltre i 35 anni, previa valutazione della qualità osservata.
Dai 5 ai 10 anni, senza che subiscano alcuna alterazione.
L’iter legislativo prevede che gli embrioni non possano essere assolutamente distrutti, ma abbandonati dalla coppia all’interno di una banca criogenica presso il mio Centro di PMA, al fine di poter essere rintracciabili in qualsiasi momento.